Né le 10 avril 1973 à Boulogne-Billancourt, Guillaume Canet se destine d'abord à une carrière de jockey. Après un accident qui l'empêche de continuer dans cette voir, il se tourne vers l'art dramatique et le cours Florent.
Après quelques passages au théâtre et dans des courts métrages, il se retrouve en 1997 face à Jean Rochefort dans le thriller Barracuda. Le film est un bide, mais l'acteur est remarqué. Il est alors sollicité par Pierre Jolivet pour En plein coeur 
Sa femme ne s'appelle pas Canette(1998) et par Remi Waterhouse pour Je règle mes pas sur les pas de mon père (1999). Désormais dans la ligue des jeunes acteurs français cotés, il embarque pour La plage (2000) de Danny Boyle, dont il partage l'affiche avec Leonardo DiCaprio et Virginie Ledoyen.
En 2002, il passe à la réalisation pour la première fois avec Mon idole, dans lequel il se met en scène face à François Berléand. Il récidive en 2006 pour le thriller Ne le dis à personne, avec François Cluzet, qui lui vaut le César du Meilleur Réalisateur. En 2010, il passe au film choral en dirigeant Les petits mouchoirs.
Refusant de se laisser enfermer trop facilement dans les comédies légères ou les histoires de beau gosse, il campe un vampire moderne dans Les morsures de l'aube (2001), un dessinateur narcoleptique dans Narco (2004), un soldat de 14-18 dans Joyeux Noël (2005), un enquêteur en milieu glauque dans La clef (2007) ou un espion malgré lui dans L'affaire Farewell (2009).

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